Composição do Meio de cultura em laboratório de micropopagação

Composição do Meio de cultura em laboratório de micropopagação

1. Agentes geleificantes:

Os meios de cultura podem ser líquidos ou sólidos. Normalmente, os meios líquidos contêm menor concentração de sais quando comparados com o meio sólido, pois a absorção de nutrientes é mais rápida. Meios de cultura muito consistentes limitam a absorção de nutrientes pelo explante.
Os meios sólidos normalmente são solidificados com ágar ou gelrite. A gelatina é considerada tóxica para células vegetais, pois é uma proteína de origem animal.
Uma das diferenças entre os agentes geleficantes está no grau de pureza de cada marca, no ágar podemos encontrar concentrações de 23 a 46 mg de sódio; 8 a 36 mg Cálcio e 2,4 a 16,8 mg magnésio e 1 a 12 mg. l-1 de Boro e concentrações relativamente altas de sulfato e cloreto, enquanto o gelrite possui 30 vezes mais potássio e 40 vezes mais magnésio que o ágar.

- ÁGAR: é um polissacarídeo extraído de algas marinhas. A consistência do meio de cultura depende de vários fatores:
* pH: Se o meio de cultura for autoclavado num pH abaixo de 4,5 ocorre uma hidrólise e o meio não se solidifica. Normalmente o pH é mantido entre 5 a 6 para orquídeas.
* Concentração de sais: Meios de cultura com menor concentração de sais ficam mais sólidos do que meios com concentrações mais altas de sais minerais.
O ágar alimentício é muito utilizado por seu menor custo, mas quantidades maiores são necessárias para obter a consistência do meio por isto a quantidade de impurezas também é maior.

- GELRITE: São gomas produzidas por certas bactérias. Essas gomas são polissacarídeos de ácido glucurônico, ramnose e glicose com grupos de O-acetil. Geralmente utilizam-se cerca de metade da concentração do ágar para a mesma consistência do meio de cultura.
Alguns estudos indicam que o gelrite pode induzir vitrificação em algumas culturas.
A utilização combinada de gel e ágar eliminam a vitrificação e mantém a taxa de multiplicação inalterada.

2. Carvão ativado:

Tem como função escurecer o meio de cultura impedindo a incidência de luz na base do espante, reduzindo a oxidação, além de também adsorver compostos tóxicos presentes no agar ou formados durante a oxidação.
Outra possível explicação sobre sua ação está no aumento da areação quando adicionadas ao meio de cultura, além da possibilidade de absorção de etileno, que pode inibir o crescimento e a diferenciação de plântulas.
A diferença entre o carvão ativado e o comum é que no carvão ativado as impurezas são removidas, e o carvão comum não tem a função de adsorver substancias tóxicas por causa da relação entre o tamanho e o peso de suas partículas.

3. Sacarose:

É a fonte de carboidratos mais utilizada nos meios nutritivos.

4. Nutrientes: Macro nutrientes e micro nutrientes.

5. Peptona: fontes de nitrogênio, normalmente contem 13 a 16% nitrogênio, dependendo da marca.

6. Outros componentes: Banana, batata, tomate, maça, mamão, cenoura, entre outros.

Composição da polpa da banana - mg/100gr de banana: cálcio 5,71; ferro 1,37; fósforo 85; potássio 251,43; inositol 34; aminoácidos, vitamina A; vitamina C, substâncias promotoras de crescimento (similares a auxina e citocinina), entre outros.

7. Utilização de reguladores de crescimento:

A utilização de reguladores tem como função suprir possíveis deficiências dos teores endógenos de hormônios nos explantes.
As auxinas e as citocininas são as classes de reguladores de crescimento mais utilizadas em cultura de tecidos. A formação de raiz, da parte aérea e do calo é regulada pela disponibilidade e interação entre essas duas classes de reguladores de crescimento.

7.1.Auxinas: AIA, ANA, AIB, ApCFA, 2,4D, Picloram e ANOA.

Nas plantas, as auxinas são sintetizadas em regiões de crescimento ativo como meristema apical, gemas axilares e folhas jovens e depois translocados para diferentes órgãos. Tem como função promover crescimento do caule, folhas e raízes, além de ser responsável pela dominância apical e ainda podem ser utilizadas como herbicida (2,4-D). Também promovem desenvolvimento de raízes adventíceas no caule.
No meio de cultura, a auxina mais utilizada para estimular a multiplicação é o ANA, seguido de AIB e AIA. Concentrações altas de auxinas podem estimular o enraizamento e a formação de calos em detrimento da multiplicação.
Utilização: São bases orgânicas por isto devem ser dissolvidas em base KOH ou NaOH 0,1N na proporção de 3 gotas para cada 10 mg de auxina.

7.2.Citocininas: Cinetina , BA, 2iP, zeatina, PBA, Tidiazuron.

As citocininas promovem divisão, alongamento e diferenciação celular, retardam a senescência das plantas, promovem a quebra de dominância apical e induzem a proliferação de gemas axilares.
A citocinina mais utilizada é o BA, seguido de cinetina e 6-BA. Tem como função a multiplicação da parte aérea e a indução de gemas adventíceas.
Utilização: São ácidos orgânicos por isto devem ser dissolvidas em HCl 0,1N na proporção de 3 gotas para cada 10 mg de citocinina.

7.3. Balanço hormonal:
O balanço hormonal entre citocininas e as auxinas é muito importante para o controle da morfogênese e da formação de órgãos em cultura de tecidos.
De modo geral podemos afirmar que:
- Na ausência de raízes: aumentar a concentração de auxinas e diminuir a de citocininas.
- Aumentar a formação de parte aérea: aumentar a concentração de citocininas e diminuir a concentração de auxinas.
- Para formação de parte aérea e raízes: Este balanço varia de espécie para espécie, sendo necessário um estudo antes da sua utilização.
Deve-se prestar atenção nas concentrações utilizadas, pois o excesso de citocinina pode causar vitrificação nas plantas cultivadas in vitro.

7.4. Giberilinas: GA3
As giberilinas promovem o crescimento da planta, os seus efeitos podem ou não ser semelhantes ao das auxinas. A diferença entre as duas é que a giberilina tem efeito quando aplicadas em plantas inteiras enquanto as auxinas são mais eficientes quando aplicadas em segmentos de plantas.
O GA3 é utilizado em cultura de tecidos para estimular o alongamento da parte aérea, mas sua eficiência é baixa, por isto não é utilizada com freqüência em cultura de tecidos.
Utilização: Devem ser dissolvidas em etanol na proporção de 1ml para cada
50 mg.

Os reguladores devem ser armazenados no congelador, em proporções equivalentes à utilizada em um lote de meio de cultura, com exceção do AIA, que deve ser preparado e adicionado ao meio um pouco antes da autoclavagem por causa da sua instabilidade.
Muitos laboratórios utilizam à água de coco que é retirada de cocos verdes ou maduros e também a massa/polpa do coco. A água de coco contém sais minerais, mio inositol, nucleotidios e citocininas.

Bibliografia:
Boletim técnico n°174- Micropropagação de plantas ornamentais- Tombolato, F.F.C e Costa, A.M.M, IAC- campinas
Micropropagation of orchids, Arditti, J e Ernest, R., 1993
Cultura de tecidos e transformação genética de plantas vol.1, Caldas, L.S., Buso, J.A., Torres, A.C. Embrapa