Contaminação em Laboratório de Micropropagação

A contaminação em um laboratório de cultura de tecidos pode ter várias causas, entre elas: microorganismos na superfície ou no interior dos explantes, falhas nos procedimentos durante a inoculação/ multiplicação do material ou na esterilização do meio de cultura, contaminação causada por formigas, tripes ou ácaros.

1. Fontes de contaminação:

A. Na planta matriz:

Causas:
- Uso de bokashi ou outro adubo orgânico durante a formação dos brotos.
- Tecidos de plantas ou brotos em contato com o solo.
- Plantas cultivadas no campo, sem ambiente protegido e com irrigação por aspersão.

Como evitar:
- Usar adubação líquida ou retirar a adubação orgânica durante a formação do broto.
- Manter as plantas matrizes em ambiente protegido (estufas) e evitar irrigar as plantas por aspersão (por cima), para evitar a entrada de microorganismos.
- Aplicar um fungicida de contato de largo espectro 10 dias antes da retirada do meristema.
- Lavar/limpar o broto antes de levar para a sala de inoculação. Utilizar sabão em pedra para este fim.

B. Durante a inoculação da cultura:

Causas:
- Matriz contaminada.
- Falhas na inoculação/esterilização ou manipulação dos explantes.
- Bactérias endógenas.

Como evitar:

- Cuidados durante a inoculação e repicagens: Trocar regularmente as soluções para esterilização dos explantes, verificar o prazo de validade e manter o frasco aberto na geladeira. Verificar cuidadosamente os frascos antes de abrir.

- Detecção de contaminação por bactéria nos estágios iniciais:
Ao introduzir uma cultura no laboratório, podemos detectar a presença de bactérias das seguintes formas:
* Manter no meio líquido sob agitação por 3 semanas em uma temperatura de 26°C para favorecer o desenvolvimento de bactérias.
* Adicionar peptona ou extrato de levedura, na proporção de 1,5 g para cada litro da solução de meio de cultura.
* A adição de gel rite é interessante, pois facilita a visualização de contaminantes.

- Matrizes contaminadas por bactérias endógenas: São as bactérias que se encontram dentro da planta. Muitas destas bactérias ficam latentes e se manifestam em condições específicas, como por exemplo, a transferência para um meio de enraizamento, alteração no pH do meio ou mudança na temperatura da sala de crescimento. Frequentemente o aparecimento repentino de contaminação causada por bactérias após várias repicagens ou durante o enraizamento, podem ser atribuídos a estes contaminantes, que foram inoculados juntamente com o meristema.

- Utilização de antibióticos: testar antes, pois podem causar fitotoxidez às plantas dependendo da espécie e do tipo de material utilizado.

Como decidir qual tipo de antibiótico usar? Procurar na literatura quais são efetivos e quais não são fitos tóxicos e depois testar em um lote pequeno.

Tabela com os principais bactericidas e bacteriostáticos utilizados:

Bacteriostático Bactericida
Inibe o crescimento da bactéria Letal para a bactéria
Podem ter efeito bactericida em altas concentrações Bacteriostático em baixas concentrações
Produtos: Produtos:
Choramphenicols Cephalosporins
Tetracyclines Aminoglycosides
Erythromycin (Kanamycin, streptomycin
Neomycins ,Gentamicin) Penicillins
Polymyxins(Polymyxin-B)
Rifamycins (Rifampicin)

Principais fungicidas utilizados:
Amphotericin B, Cycloheximide, Nystatin, Griseofulvin, Petachloronitrobenzene (PCNB), Thiabendazole.

Para eliminação de vírus: Ribavirin.
Normalmente utiliza-se de 20-100 µg/ml, mas existem culturas com fitotoxidez em doses acima de 30 µg/ml. Pode aumentar a mutação.

O tipo de antibiótico utilizado varia de acordo com o contaminante. Normalmente utiliza-se streptomicina, polymyxin B, rifampicina, cefalospirin, penicilina, vancomicina, gentamicna ou a combinação entre eles.
Muitos antibióticos são mais efetivos em pH alcalino, outros não são muito estáveis, como por exemplo, o grupo das penicilinas que ficam estáveis de 24-48h na temperatura da sala de crescimento. Meios de cultura com muitos sais também podem diminuir o efeito dos antibióticos.
Os antibióticos podem inibir o crescimento da planta, reduzindo a taxa de multiplicação. Segundo alguns estudos, a estreptomicina é a que mais inibe o crescimento da planta, seguido do polymyxin B e da rifampicina.
Alternativa para o uso de antibióticos: mergulhar o material contaminado em solução com o bactericida em vez de adicioná-lo ao meio de cultura.
Exemplo de uso:
- Penicilina G: 10-100?g/ml para semeadura de cattleyas.
- Sulfato de gentamicina: 50 ?g/ml para semeadura de cattleyas, para Vandas e Cymbidium ocorre fitotoxidez.

C. Contaminação por agentes externos: formigas, tripes e ácaros.

Formigas, tripes e ácaros podem ser fontes de contaminação dentro do laboratório. As formigas são atraídas por restos de meio de cultura, por isto devemos manter a sala de preparo de meio sempre limpa, pois uma vez instalada, a infestação por formigas se espalha, sendo necessário à utilização de iscas para combatê-las.
Tripes e ácaros causam a contaminação por fungos e bactérias, pois eles conseguem entrar nos frascos, mesmo com o uso de parafilme ou filme de PVC. Uma vez instalado, é difícil eliminar, pois os produtos aplicados não têm efeito dentro dos frascos, conseguimos eliminar apenas os ácaros ou tripes que estão fora dos frascos.
Como evitar:
- Manter a sala de crescimento limpa.
- Evitar entrar no laboratório após trabalhar nas estufas.
- Lavar as caixas plásticas, frascos e outros materiais que estavam na estufa antes de colocá-los no laboratório.

* Em caso de contaminação com ácaros: pulverizar Duocide plus (desinfecção hospitalar), retirar os materiais contaminados com freqüência, pois possuem um ciclo reprodutivo rápido, de um mês, e após este período saem dos frascos, contaminando outros.

2. Importância dos Treinamentos:

As pessoas são consideradas uma das maiores fontes de contaminação em
Ambientes classificados, pois possuímos uma flora microbiana capaz de gerar inúmeros contaminantes.
É importante seguir uma rotina para entrar e sair da sala limpa, além de cuidados com a higiene pessoal, como: manter o cabelo preso, usar avental, máscara, lavar bem as mãos e unhas, calçados limpos, não comer, beber ou fumar na sala limpa, entre outros.

Alguns estudos verificaram que mais da metade de bactérias isoladas em laboratórios de micropropagação eram de Staphylococcus, Micrococcus e Lactobacillus, que normalmente habitam a pele e outros tecidos humanos ou de animais (Kloss &Schleifer, 1986 e Kocur 1986), demonstrando que uma grande porção de contaminantes encontrados em culturas antigas foi introduzida através da manipulação.

3. Materiais contaminados:

Manter fora da sala limpa e autoclavar por pelo menos 30 minutos antes de lavar as vidrarias, pois existem alguns microorganismos como Bacillus cereus e circulans que podem sobreviver a autoclavagem a 120°C por vinte minutos.

4. Instrumentos:

Existem bactérias que são resistentes ao álcool, a flambagem rápida e ao hipoclorito de sódio, portanto recomenda-se autoclavar os instrumentos regularmente, ferver os instrumentos por pelo menos 20 minutos ou flambar no Bico de Bunsen por 12 segundos. A utilização de um Microesterilizador elétrico pode ser interessante.

5. Meio de cultura:

Recomendam-se autoclavar os meios de cultura no mesmo dia em que são preparados. Se não for possível, manter os meios restantes refrigerados até a autoclavagem no dia seguinte.
Normalmente os meios de cultura são autoclavados a 120°C durante 20 minutos, em casos de dúvidas durante a autoclavagem, manter os frascos armazenados por pelo menos 5 dias antes de usar.

6. Viroses:

Ss viroses em orquídeas são disseminadas através do manuseio das plantas e de instrumentos como tesouras de poda.
Os instrumentos devem ser esterilizados com trifosfato de sódio ou flambagem prolongada (até ficar incandescente).
Existem kits para detecção de viroses CyMV (Cymbidium Mosaic Vírus) e
ORSV (Odontoglossum Ring Spot Vírus), pois muitas vezes as plantas estão contaminadas, mas não apresentam sintomas. Estas viroses não são transmitidas por insetos.

Por: Sandra Shinoda